Advanced Science｜CD9⁺ B细胞如何“终结”生发中心？单细胞揭示B-Tfh细胞互作新机制

近日，广州医科大学附属第一医院（呼吸疾病全国重点实验室）张孝文教授团队在 Advanced Science 发表论文，廖雯静博士为共同第一作者。论文题目为“CD9⁺ B Cells Induce T Follicular Helper Cell Apoptosis to Regulate Germinal Center Regression”，揭示了生发中心退化与终止的新机制。

腺样体是研究人类生发中心（GC）退化的天然窗口，但GC如何退化、终止，机制长期不清楚。该研究以13例腺样体+5例扁桃体为样本，用10x & BD双平台进行scRNA-seq（91,741细胞）构建GC-B细胞生态图谱，发现并验证了一个CD9⁺ B细胞亚群——通过ALCAM-CD6等细胞通讯轴促进滤泡辅助性T细胞（Tfh）凋亡，并可能参与生发中心B细胞（GC-B）的终止调控过程，构成驱动GC退化的双向负反馈回路。烈冰生物协助完成单细胞 RNA 测序实验与数据分析。

图1 论文摘要图：CD9⁺ B 细胞—Tfh 互作模型

研究设计

样本与分组：研究共纳入 18 例 scRNA-seq 样本（13 例腺样体、5 例扁桃体）。其中 11 例腺样体腺样体阻塞比例（腺样体阻塞面积/鼻咽气道面积×100%）分组（<50% 为 ANH 组、≥50% 为 AH 组）；2 例成人残余腺样体（31、36 岁）样本被排除。另取 AH/ANH 组织用于流式、免疫荧光、CyTOF、透射电镜等验证，并以 CD9 基因敲除（CD9-KO）与野生型（CD9-WT）小鼠开展体内功能研究。

单细胞测序与分析流程：scRNA-seq 采用 10x Genomics 与 BD Rhapsody 双平台测序，经质控后以 Harmony 算法整合，共获得 91,741 个细胞（10x 平台 72,647 个、BD 平台 19,094 个），覆盖腺样体和扁桃体两类组织；依据标志基因鉴定出 B 细胞、浆细胞、CD4⁺/CD8⁺ T 细胞、肥大细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞等类型。

多维检测与机制分析：围绕免疫微环境组成、CD9⁺ B 细胞生态与 Tfh 互作机制，研究者建立系统性验证体系：

· 流式细胞术：验证 B 细胞、CD9⁺ B 细胞与 Tfh 细胞（CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺）比例及凋亡变化。

· 质谱流式（CyTOF）：在独立技术平台验证 CD9⁺ B 细胞与 CD4⁺ T 细胞亚群。

· 多重免疫荧光：组织原位定位 CD9⁺ B 细胞与 Tfh 细胞。

· 透射电镜：观察 CD9⁺ B 细胞的坏死样形态改变。

· RT-qPCR 与 Western blot：验证内质网应激基因（PDIA4、BIK、LMAN1）与 FOXP1 表达。

· shRNA 敲低与共培养：分别敲低Tfh细胞和CD9⁺ B细胞中的候选配体-受体分子，验证互作的功能后果。

· CD9 敲除小鼠与 ELISA：体内验证 CD9 对 GC-B 细胞与抗体产生的影响。

研究结论

1. AH 的免疫景观：B 细胞增多、T 细胞减少

与 ANH 相比，AH 组织 B 细胞丰度显著升高、CD4⁺ 与 CD8⁺ T 细胞丰度显著降低，该免疫景观在单细胞与流式两个层面得到验证。B 细胞丰度与腺样体大小呈显著正相关（R = 0.9，p = 3.5 × 10⁻⁸），提示 B 细胞（尤其生发中心 B 细胞）是腺样体体积的关键影响因素。

图2 腺样体组织单细胞图谱：细胞类型鉴定、AH 与 ANH 细胞丰度差异及 B 细胞丰度与腺样体大小的正相关

2. GC-B 细胞生态：7 个亚群与独特的 CD9⁺ B 细胞

对 GC-B 细胞聚类共鉴定出 7 个亚群，包括暗区（DZ，高表达 MKI67、NUSAP1 等增殖相关基因）与明区（LZ）亚群。其中 CD9⁺ B 细胞被归为明区亚群 LZ_CD9：主要处于 G1 期、增殖基因低表达，高表达 CD83、CD86、CD27 等经典明区标志，并兼具 CD24、CD38、CD27 等调节性 B 细胞（Breg）标志，提示其与Breg细胞存在一定表型重叠；但与既往报道的 CD9⁺ Breg 相比，其整体转录谱与功能并不相同。

图3 腺样体 GC-B 细胞生态：7 个亚群鉴定与标志基因

3. FOXP1：CD9⁺ B 细胞分化的潜在调控因子

拟时序分析（cytoTRACE、Monocle2）显示 CD9⁺ B 细胞分布于全程中的各个阶段；pySCENIC 基因调控网络（GRN）将 287 个候选调控因子聚为 7 个模块，CD9⁺ B 细胞的调控因子主要来自含 26 个因子的 M3 模块（含 POLE4、HMGB1、FOXP1 等）。其中 FOXP1调控活性在CD9⁺ B细胞中呈现更特异的分布 ，FOXP1的表达模式与CD9的分布模式更加一致；RT-qPCR、Western blot及流式细胞术验证显示，FOXP1在CD9⁺ B细胞中的RNA及蛋白表达水平均高于CD9⁻ B细胞。敲低 FOXP1（sh-FOXP1）后，CD19⁺CD27⁺CD9⁺ B 细胞比例显著下降，提示FOXP1可能参与维持CD9⁺ B细胞分化。

图4 GC-B 细胞拟时序发育轨迹与基因调控网络分析：FOXP1 对 CD9⁺ B 细胞分化的调控

4. CD9⁺ B细胞丰度与腺样体肥大程度负相关

CD9⁺ B 细胞在 AH 组显著减少，其丰度与腺样体大小（R = -0.59，p = 0.043）及腺样体阻塞比例≥50% 的发生（R = -0.65，p = 0.016）均呈显著负相关，提示CD9⁺ B细胞可能是参与调控腺样体发育与萎缩过程的重要细胞亚群 。体内证据进一步支持：与野生型相比，CD9 敲除小鼠腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结与脾脏 GC-B 细胞显著减少，血清 IgG1 显著降低（IgM 无显著差异），提示CD9⁺ B细胞可能是参与调控腺样体发育与萎缩过程的重要细胞亚群。

图5 CD9⁺ B 细胞丰度与腺样体大小、腺样体阻塞比例≥50% 的发生负相关，以及 CD9 敲除小鼠外周淋巴器官 GC-B 细胞减少与血清 IgG1 降低

5. 内质网应激与细胞死亡：AH 中 CD9⁺ B 细胞减少的潜在机制

CD9⁺ B 细胞中，AH 组 ZFAS1、PFN1、MIF 等基因显著上调，差异基因富集于细胞衰老、缺氧、氧化应激及细胞死亡相关通路，并通过GSEA、RT-qPCR 与 Western blot 均证实其内质网应激基因 PDIA4、BIK、LMAN1 显著上调。透射电镜显示 AH 组 CD9⁺ B 细胞呈坏死样形态（质膜破裂、胞质与细胞器肿胀、内容物外漏）；流式细胞术证实其凋亡比例显著升高（p < 0.0001）。缺氧相关反应与内质网应激可能参与CD9⁺ B细胞死亡相关过程 ，为CD9⁺ B细胞在肥大腺样体中的减少提供了可能的机制解释。

图6 CD9⁺ B 细胞在 AH 中的基因表达模式：细胞死亡相关通路富集、坏死样形态（透射电镜）与凋亡比例升高

6. Tfh细胞增多：与CD9⁺ B细胞呈负相关关系

AH 组 Tfh 细胞（CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺）丰度显著高于 ANH 组，并在单细胞测序、CyTOF、流式细胞术与多重免疫荧光四个层面一致验证；Tfh 细胞富集于 T 细胞激活、免疫应答与 T 细胞受体信号等通路。Tfh 丰度与腺样体大小呈正相关趋势（R = 0.53，p = 0.075，未达显著），与 CD9⁺ B 细胞丰度呈显著负相关（R = -0.67，p = 0.017），两者此消彼长。

图7 Tfh 细胞在腺样体肥大中的增多：单细胞、CyTOF、流式与多重免疫荧光的交叉验证

7. 机制闭环：CD9⁺ B 细胞经 ALCAM-CD6 等互作可能促进 Tfh 凋亡

CellPhoneDB 分析显示 Tfh 与 CD9⁺ B 细胞存在显著细胞通讯，关键配体-受体对包括 LTA-TNFRSF1B、ALCAM-CD6、CD58-CD2 等（共 6 对候选互作，ALCAM-CD6 轴尤为突出）。功能实验双向验证：Tfh 敲低配体（TNFRSF1B、TIGIT、CD6、CD2、ICAM3）后与 CD9⁺ B 细胞共培养，后者 CD27、IgG 产生增加、IgM 减少，提示其成熟分化增强；CD9⁺ B 敲低受体（TNF、LTA、PRR3、ALCAM、CD58、ALB2）后与 Tfh 共培养，Tfh 凋亡被显著抑制，反向证实该亚群经上述互作诱导 Tfh 凋亡。据此提出机制模型：在腺样体发育过程中，高丰度的Tfh细胞会抑制CD9⁺ B细胞亚群的成熟和分化；随着腺样体发育逐渐改善，CD9⁺ B细胞数量显著增加，并通过促进Tfh细胞凋亡调控生发中心（GC）的回缩过程。

图8 CD9⁺ B 细胞与 Tfh 细胞互作的探索与功能验证：细胞通讯、配受体敲低与共培养实验

本研究创新性

本研究为揭示生发中心（GC）退化机制的单细胞组学研究，创新性体现在两方面。

技术体系上，采用10x Genomics与BD Rhapsody双平台测序、Harmony整合，获得91,741个细胞，覆盖腺样体与扁桃体，表明了双平台单细胞数据联合策略的可行性与可靠性；从scRNA-seq发现CD9⁺ B细胞亚群，到CyTOF、免疫荧光、电镜、分子与功能验证、CD9敲除小鼠体内验证CD9对GC-B细胞反应的影响，形成完整证据链；并联合拟时序、基因调控网络与细胞通讯分析，层层回答“是什么”“谁在调控”“如何互作”。

研究设计上，本研究填补了GC退化终止机制的空白，系统刻画人类腺样体GC-B细胞生态；提出模型——发育早期Tfh抑制CD9⁺ B细胞分化，随发育推进CD9⁺ B细胞增多，经ALCAM-CD6等通路促进Tfh凋亡，推动GC退化与腺样体萎缩；ALCAM-CD6、FOXP1等关键节点提示了潜在的机制调控方向。